大肠杆菌蛋白表达
来源:admin 浏览量: 发布时间:2018-04-28 13:58:12
(一) 基因设计及合成我们为客户提供密码子、GC含量和特殊基因序列的优化等基因设计工作,能提高转录和翻译效率,提高mRNA稳定性。
(二) 载体构建 我们有如pET21a(+),pET28a(+)、pGEX系列等三十多种成熟原核表达载体可供选择,这些载体分别具有提高表达量、促进分泌表达、促进可溶表达、促进二硫键形成等特征。并可针对目的蛋白性质、制备工艺要求以及大肠杆菌系统的特点,优化基因序列和载体构建,以求得到最优的表达系统等。在构建表达载体时主要通过以下几方面进行优化:1)启动子的选择,提供强启动子、中强启动子及弱启动子的选择;2)信号肽的选择,提供多种不同分泌机制的信号肽供选择,找到最优的表达信号肽;3)促表达伴侣分子的选择,有多种促可溶表达分子伴侣、促二硫键形成分子伴侣、促折叠分子伴侣可供选择;4)纯化标签的选择,为方便纯化制备,提供多种亲和纯化标签供选择,如His6标签、GST标签、MBP标签、Strep标签等。
(三) 表达菌株建立及小量诱导表达 我们拥有BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3) Star、等十多种表达宿主菌可供选择,主要从增强质粒稳定性、提高表达量、促进含稀有密码子基因的表达、提供胞内蛋白二硫键形成环境、促进毒性蛋白表达等方面进行表达菌株的选择,并进行小量诱导表达和检测。
(四) 重组蛋白大规模 表达工艺优化我们可以为客户提供3L、10L等不同量级的蛋白发酵工艺的优化,主要从培养方式、培养基配制、培养液pH、培养温度、培养时间等多个角度入手,对重组蛋白的大规模表达工艺进行优化。
(五) 内毒素控制与去除 系统表达的蛋白产品会夹带大量内毒素残留,其主要来源为大肠杆菌细胞壁成分脂多糖。内毒素因为其本身异质性,分子大小不一、疏水性很强、带很强负电荷,往往与目的蛋白结合在一起,极不易分开,所以去除起来很困难,迄今并无很好的方法。我们通过全流程控制和针对性去除相结合的方法控制残留水平.
(六) 蛋白鉴定我们熟练掌握SDS-PAGE、蛋白浓度检测、western blot、流式细胞术等定性或者定量分析的方法进行重组蛋白鉴定。