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HRP标记SA的方法

来源:admin  浏览量:  发布时间:2018-04-28 14:48:49

采用过碘酸钠法标记链霉亲和素,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与SA的氨基结合,形成HRP-SA。

1、 HRP 1mg与60mmol/L NaIO4 0.1mL于4℃作用30min,加入0.16mol/L

乙二醇0.1ml 30min后,加SA 1mg,4℃静置24h。

2、 透析过夜,加等体积的饱和硫酸铵溶液,4000r/min离心15min,将沉淀

溶解于pH 7.4的PBS中。280nm下测吸光度并进行200~800nm波长扫描。

     3、用sephadex G-75装柱。HRP-SA上样100μl,用0.025mol/L KCl-0.2mol/L乙酸缓冲液以0.5ml/2min的速度淋洗,分部收集。用DU800紫外分光光度计测量收集的各管样品的OD280值,绘制柱层析图谱(洗脱曲线),据此收集蛋白峰。透析脱盐和用PEG-2000进行浓缩。

4、取HRP-SA 10μl,去离子双蒸水稀释10倍,用紫外分光光度计在200~800nm波段进行扫描。其中,在230nm处有最大吸收峰,可能是溶剂的吸收峰;在280nm有次吸收峰,这是HRP-SA吸收峰。

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