蛋白A检测ELISA试剂盒说明书

96次检测

货号Bk301

保存：2-8℃

有效期：6个月

只供科研和生产用，不应用于治疗或诊断，使用前请认真完整地阅读此说明书！

适用范围

此蛋白A检测ELISA试剂盒用来定量检测重组耐碱性等非天然的蛋白A，只能用于科研和生产，不能应用于人或动物疾病的诊断治疗。本试剂盒提供一个样品的酸化处理方法，把蛋白A从IgG产品中分离出来，在人源化单抗浓度高达2mg/mL的情况下，蛋白A的检测限低至78pg/mL以下。

检测原理

此试剂盒采用标记生物素系统的双抗夹心的技术方法。酶标板预包被蛋白A的特异性单克隆抗体，含有蛋白A的样品使用样品稀释液进行稀释，然后酸化液混合使蛋白A从抗体产品中的分离出来，样品和预包被在酶标板上的蛋白A捕获抗体反应。再加入生物素标记的检测抗体反应形成夹心三明治复合物。然后洗涤去除没有参与反应的物质，加入亲和素标记的HRP，短暂孵育后，进行TMB显色，然后加入终止液终止显色反应，在450nm处检测吸光值，OD值和样品含量成正比关系。

需要用到但试剂盒没有提供的东西

1. 10-1000μL的移液器，单道和多道

2. 100mL和1000mL的烧杯

3. 去离子水

4. 各种型号离心管

5. 酶标仪（测450nm）

6. 数据处理分析软件

试剂盒组成成分：

试剂准备：

1. 本试剂盒使用前请放置室温（20-25度）

2. 洗涤液配制：30mL洗涤液（10x）中加入270mL去离子水，混匀配成300mL工作洗涤液。如果里面有结晶，请溶解混匀再使用

3. 其他试剂不用稀释直接进行使用

样品处理过程：

1.     样品如果需要稀释，采用试剂盒内的样品稀释液进行稀释，可以在96孔板或EP管中进行。

2.     确保每个含有样品的孔（管）的体积都是100μL。

3.     另外加入100μL的标准品和质控品到孔里。

4.     每个孔再加入50μL酸化液，吹打混匀，室温孵育10min（使样品中proteinA和抗体酸化分离）。

注意事项：

1. 本试剂盒只可用于科研生产，不可用于体外诊断。

2. 终止液是2M的硫酸，避免接触到眼睛、皮肤和衣物。除此之外，本试剂盒中的试剂不会对人体有任何伤害。

3. 高或低的pH值，洗涤剂，尿素，高盐浓度和有机试剂都是ELISA方法的影响因素，pH的影响很大，样品PH值应控制在7.0-7.4。

4. 如果您在使用过程中有任何问题，请联系本公司技术部门。

试剂盒操作步骤：

1. 标准品稀释：

   8个离心管标记1#-8#，取990μL样品稀释液加入到1#和2#管中，取500μL样品稀释液加入到3#-8#管中。再取10μL样品标准品加入到1#管中，涡旋混匀后取10μL再加入到2#管中涡旋混匀。然后取2#管500μL液体加入到3#管中涡旋混匀，再取3#管500μL液体至4#管中涡旋混匀，如此直至8#管。

 稀释完全之后 ，2#-8#离心管中protein A标准品的浓度分别为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078ng/mL。另外标记一管为0ng/mL，加入样品稀释液。

标准品和样品准备好之后就进入样品处理程序。

2. 在包被有protein A抗体的酶标板中加入100μL/孔的生物素标记的结合抗体。

3. 再加入25μL酸化处理好的标准品、样品、质控品和空白到合适的孔里，室温孵育1h。

4. 甩干，洗涤4次之后，加入100μL/孔的亲和素标记HRP，室温孵育10min。

5. 甩干，洗涤4次之后，加入100μL/孔的TMB显色液，显色10min，加入100μL/孔终止液，然后在450nm处检测吸光值。

 数据处理和结果分析：

利用软件（如Curve Expert或ELISA Calc）通过标准品浓度梯度来建立检测标准曲线，把OD值和标准品浓度的对应关系用4参数逻辑拟合或三次多项式线性拟合成标准曲线，然后把检测样品的OD值带入相应曲线方程计算出对应的样品浓度。

典型的标准品检测数据和曲线拟合：

 分析方法指标：

1、精密度：在样品浓度大于0.3ng/mL的时候，检测变异系数小于10%；样品浓度小于0.3ng/mL的时候，检测变异系数略大于10%。

2、建议检测具体样品的时候，采用添加质控品的方法来考察样品基质效应对检测结果的影响。

3、本试剂盒的灵敏度为0.05ng/mL。

4、勾状效应：本试剂盒是双抗夹心一步法，产生勾状效应的浓度为10μg/mL。